![\"\"](\"https:\/\/desertking.com\/wp-content\/uploads\/2020\/07\/41598_2020_67442_fig1_html.png\")
Figura 1.<\/strong> Estructura qu\u00edmica de los compuestos triterp\u00e9nicos empleados en este estudio. (A): QS-21: C92H148O46 y (B) QA: C30H46O5.<\/p><\/div>\n El objetivo de este estudio era determinar el potencial terap\u00e9utico in vitro y el mecanismo citot\u00f3xico de la saponina QS-21 y su aglicona QA en dos l\u00edneas celulares de GC humano (SNU1 y KATO III). Para complementar el estudio in vitro y obtener informaci\u00f3n sobre el mecanismo de acci\u00f3n de QS-21 y QA para desencadenar la muerte celular, realizamos estudios de acoplamiento molecular de estos compuestos con estructuras 3D conocidas de las prote\u00ednas implicadas en la se\u00f1alizaci\u00f3n de la muerte celular, como el receptor de la muerte (DR4), la prote\u00edna FAS y la cinasa C-Jun-N-terminal (JNK1), la prote\u00edna cinasa RAC-alfa serina\/treonina (AKT1), la prote\u00edna proapopt\u00f3tica BAX, la BID y el receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR-2); Todas estas prote\u00ednas son componentes clave de la v\u00eda apopt\u00f3tica extr\u00ednseca y est\u00e1n sobreexpresadas en las c\u00e9lulas de los tumores s\u00f3lidos8,9,10.<\/p>\n Ensayo de citotoxicidad de QS-21 y QA en c\u00e9lulas de c\u00e1ncer g\u00e1strico (ensayos MTS y LDH)<\/strong> Todos los tipos celulares en estudio se trataron con QS-21 y QA en diferentes rangos de concentraci\u00f3n, durante 24 h y estaurosporina (STS) (v\u00e9anse Material y m\u00e9todos y Fig. suplementaria S1). QA y QS-21 fueron citot\u00f3xicos para las l\u00edneas tumorales KATO III y SNU1 de forma dependiente de la dosis (Fig. 2A, B); ambos compuestos apenas fueron citot\u00f3xicos para las c\u00e9lulas GES-1, una l\u00ednea celular humana normal empleada como control (Fig. 2A, B). QA mostr\u00f3 una actividad citot\u00f3xica, que fue m\u00e1s pronunciada en las c\u00e9lulas SNU1 que en las KATO III -valor IC50 de 13,6 \u00b5M y 67 \u00b5M, respectivamente (Fig. 2B, Tabla 1). Tambi\u00e9n hay que se\u00f1alar que SNU1 fue m\u00e1s sensible a concentraciones superiores a 16,0 \u00b5M de QA. En las condiciones ensayadas, QS-21 mostr\u00f3 un efecto citot\u00f3xico mayor que QA en las dos l\u00edneas celulares cancerosas estudiadas, con valores IC50 de 7,1 \u03bcM y 7,4 \u03bcM respectivamente.<\/p>\n Figura 2.<\/strong> Efecto de QS-21 y QA sobre la viabilidad celular mediante el ensayo MTS. Los datos se expresan como media \u00b1 DE de cinco experimentos independientes. (A) ****P<0,0001 cuando SNU1 y KATO III se compararon con GES-1, ***P<0,005 SNU1 frente a KATO III, *P<0,05 GES-1 frente a SNU1 y ns (no significativo) entre los grupos tratados. (B) ****P<0,0001 al comparar SNU1 y KATO III con GES-1, ** y *indican P<0,01 y P<0,05 GES-1 frente a KATO III, P<0,005 (a y b) KATO III frente a SNU1.<\/p><\/div>\n Tabla 1.<\/strong> Valores IC50 de QS-21 y QA en l\u00edneas celulares de c\u00e1ncer g\u00e1strico y l\u00edneas celulares normales humanas g\u00e1stricas.<\/p><\/div>\n QS-21 y QA son mol\u00e9culas tensioactivas y, en las condiciones empleadas en los ensayos in vitro, ambos compuestos pueden interactuar con los componentes lip\u00eddicos de las membranas biol\u00f3gicas dando lugar a la formaci\u00f3n de poros o incluso induciendo la ruptura parcial o total de las membranas. Adem\u00e1s, algunas mol\u00e9culas pueden generar la alteraci\u00f3n de la integridad de las balsas lip\u00eddicas, dando lugar a una se\u00f1al apopt\u00f3tica o proapopt\u00f3tica como la metil-\u03b2-ciclodextrina o la Avicina D12,13. Para determinar si la p\u00e9rdida de viabilidad celular detectada por el m\u00e9todo MTS en las c\u00e9lulas SNU1 y KATO III tras la exposici\u00f3n a QS-21 y QA era s\u00f3lo consecuencia de la alteraci\u00f3n de la membrana plasm\u00e1tica, o estaba implicado un mecanismo diferente, medimos la liberaci\u00f3n de la enzima citos\u00f3lica de la lactato deshidrogenasa (LDH) al medio extracelular tras la exposici\u00f3n de las c\u00e9lulas a ambos compuestos triterp\u00e9nicos. Para ello, las c\u00e9lulas se expusieron a diferentes concentraciones de QS-21 y QA que oscilaban entre 0 y 1 \u00d7 103 \u00b5M. Aunque ambos compuestos tuvieron un efecto l\u00edtico sobre las c\u00e9lulas SNU1 y KATO III en el intervalo de concentraci\u00f3n alto (Fig. 3), su impacto no fue significativo en el intervalo de concentraciones m\u00e1s bajo, en el que la prueba MTS revel\u00f3 la p\u00e9rdida de viabilidad celular, como se muestra en la Fig. 4. Por ejemplo, el valor de viabilidad estimado en t\u00e9rminos de integridad de la membrana (determinado por la liberaci\u00f3n de LDH) en las c\u00e9lulas SNU1 expuestas a las dosis IC50 para la alteraci\u00f3n metab\u00f3lica, para QA y QS-21 fueron del 78% y 72%, respectivamente, mientras que para las c\u00e9lulas KATO III fueron del 78% y 77%, respectivamente (Fig. 4). La liberaci\u00f3n de cantidades significativas de LDH s\u00f3lo se observ\u00f3 a concentraciones m\u00e1s altas de QA y QS-21 tanto en SNU1 como en KATO III (>100 \u00b5M), como se muestra en las Figs. 3A, B y 4. Este resultado demostr\u00f3 que QS-21 y QA ten\u00edan un efecto mayor en las c\u00e9lulas SNU1 que en las KATO III. Por lo tanto, concluimos que el efecto citot\u00f3xico (en t\u00e9rminos de p\u00e9rdida de viabilidad celular determinada por MTS) de QS-21 y QA no estaba relacionado exclusivamente con su capacidad de alterar las membranas (como demuestra la prueba de viabilidad celular basada en la liberaci\u00f3n de LDH). Este hallazgo fue prometedor y nos llev\u00f3 a investigar si los mecanismos apopt\u00f3ticos estaban implicados en la p\u00e9rdida de viabilidad observada (como alteraci\u00f3n metab\u00f3lica) de ambos tipos de c\u00e9lulas tumorales tras la exposici\u00f3n a dosis medias o bajas de QS-21 y QA.<\/p>\n Figura 3.<\/strong> An\u00e1lisis de la actividad de la LDH. Los resultados se expresan como porcentaje de liberaci\u00f3n de LDH menos el valor de control del veh\u00edculo. a, b y c indican un P <0.0001, P<0,01 y P<0,05, respectivamente, cuando se compara SNU1 y KATO III con c\u00e9lulas no tratadas, ****, *** y * indican un P<0.0001, P<0,005 y P<0,05 entre SNU1 frente a KATO III tratadas con QS-21 (A) o QA (B) y ns (no significativo) entre l\u00edneas celulares. Los puntos de datos son valores medios \u00b1 DE de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado.<\/p><\/div>\n Figura 4.<\/strong> Correlaci\u00f3n entre los ensayos MTS y LDH. Comparaci\u00f3n del efecto de QS-21 y QA sobre la viabilidad metab\u00f3lica (determinada por MTS) y la viabilidad en t\u00e9rminos de integridad de la membrana (determinada por la liberaci\u00f3n de LDH) de las c\u00e9lulas SNU1 y KATO III. (A) y (B) QS-21 sobre SNU1 y KATO III, respectivamente. (C) y (D) QA en SNU1 y KATO III, respectivamente.<\/p><\/div>\n Evaluaci\u00f3n del efecto de las fracciones Q<\/strong>S-21 y QA sobre el da\u00f1o del ADN y la inducci\u00f3n de caspasas<\/strong> Figura 5.<\/strong> QS-21 y QA inducen la apoptosis por fragmentaci\u00f3n del ADN (ensayo TUNEL) en SNU1 y KATO III. (A) y (B) son im\u00e1genes representativas de la tinci\u00f3n TUNEL. Las c\u00e9lulas TUNEL positivas (fluorescencia verde brillante, Fluoresce\u00edna 12-dUTP) con el kit DeadEnd Fluorometric TUNEL y TUNEL positivas (fluorescencia roja) con Click-iT TUNEL Alexa Fluor 594, se observaron tras el tratamiento de 1 \u00d7 105 c\u00e9lulas con 10 \u03bcM QS-21 y 100 \u03bcM QA, respectivamente. Como control negativo se utilizaron c\u00e9lulas no tratadas y como control positivo c\u00e9lulas tratadas con 0,3 y 3,0 \u03bcM de STS. Todas las c\u00e9lulas SNU1 se ti\u00f1eron con PI (fluorescencia roja) y las c\u00e9lulas KATO III se ti\u00f1eron con Hoechst 33342 (fluorescencia azul). Las flechas blancas indican las c\u00e9lulas apopt\u00f3ticas. (C) **P<0,005, ***P<0,0005 y ****P<0,0001 c\u00e9lulas tratadas con SNU1 frente al grupo de control; (D) **P<0,005 y ****P<0,0001 c\u00e9lulas tratadas con KATO III frente al grupo de control. En cada experimento se examinaron ocho campos con un aumento de \u00d7 400 y todos los datos se muestran como media \u00b1 DE de tres experimentos distintos.<\/p><\/div>\n Figura 6.<\/strong> QS-21 y QA inducen la apoptosis en SNU1 y KATO III. Se trataron 1 \u00d7 105 c\u00e9lulas con QS-21 (10 \u03bcM) o QA (100 \u03bcM) durante 24 h y se determin\u00f3 la distribuci\u00f3n de las c\u00e9lulas apopt\u00f3ticas mediante citometr\u00eda de flujo. Se estim\u00f3 el porcentaje de c\u00e9lulas apopt\u00f3ticas tempranas y tard\u00edas (tasa de apoptosis) en comparaci\u00f3n con la c\u00e9lula no tratada y como control positivo se trataron las c\u00e9lulas con Cisplatino (55 \u03bcM). SNU1 (panel izquierdo) y KATO III (panel derecho).<\/p><\/div>\n Figura 7.<\/strong> QS-21 y QA inducen la actividad de la caspasa 3\/7 en SNU1 y KATO III. Se trataron aproximadamente 2 \u00d7 104 c\u00e9lulas con QS-21 (10 \u00b5M) o QA (100 \u03bcM) durante 24 h. Se midi\u00f3 la Caspasa-Glo 3\/7 mostrando que QS-21 y QA induc\u00edan la actividad de la caspasa 3\/7 en ambas l\u00edneas celulares. Columnas, media (n = 5); barras, DE. ****o # P<0,0001; ** P<0,005 y ns no significativo.<\/p><\/div>\n Caracter\u00edsticas fisicoqu\u00edmicas in silico y acoplamiento molecular<\/strong> Tabla 2. Energ\u00edas libres de enlace y par\u00e1metros in silico de QS-21 y QA. aReceptor de muerte 4 (DR4), bAKT1, cprote\u00edna apopt\u00f3tica BAX, dprote\u00edna apopt\u00f3tica BID, eFGFR2, fprote\u00edna FAS y gJNK1. hLos datos in silico se calcularon con el software MarvinSketch (versi\u00f3n 18.24.0, ChemAxon Ltd.).<\/p><\/div>\n La figura 8 representa el sitio de uni\u00f3n potencial y la pose de QS-21 y QA acoplados en 2BID, donde se puede observar que ambos compuestos se encuentran en la misma cavidad de uni\u00f3n de 2BID. Sin embargo, QS-21 y QA difieren tanto en orientaci\u00f3n como en conformaci\u00f3n en el sitio de uni\u00f3n, lo que conduce a una interacci\u00f3n selectiva de cada compuesto con residuos amino\u00e1cidos espec\u00edficos del sitio de uni\u00f3n. Las interacciones de cada compuesto con el bolsillo de uni\u00f3n del 2BID se rigen principalmente por enlaces de hidr\u00f3geno e interacciones hidrof\u00f3bicas. Los amino\u00e1cidos responsables del enlace de hidr\u00f3geno de 2BID con QS-21 son Gly43, Asp73, Glu82 y Arg86, mientras que con QA son Asn33 y Leu39 (Fig. 8B). Por otra parte, los amino\u00e1cidos responsables de los contactos hidr\u00f3fobos con QS-21 son Phe24 y Trp53, mientras que con QA es Leu39 (Fig. 8C). Adem\u00e1s, como se muestra en la Tabla 2, se determinaron los valores logD y pKa de los compuestos. QS-21 y QA mostraron valores de pKa 3,28 y 4,60, respectivamente. Estos resultados indican que ambos compuestos deber\u00edan encontrarse principalmente como sus respectivas formas ani\u00f3nicas a un pH fisiol\u00f3gico (~ 7,4). Adem\u00e1s, QS-21 y QA mostraron los valores LogD7.2 – 6,92 y 1,85, respectivamente, lo que indica que QS-21 es un compuesto hidr\u00f3filo y QA es un compuesto hidr\u00f3fobo.<\/p>\n Figura 8.<\/strong> Sitio de uni\u00f3n potencial para la pose de menor energ\u00eda de QS-21 y QA acoplados dentro de la prote\u00edna proapopt\u00f3tica BID (entrada PDB: 2BID). (A) Representaci\u00f3n en cinta de la 2BID con los ligandos dentro del sitio activo. QS-21 y QA est\u00e1n coloreados en verde y azul, respectivamente. Una inspecci\u00f3n detallada del sitio de uni\u00f3n dentro de la 2BID muestra los amino\u00e1cidos responsables de la interacci\u00f3n con QS-21 (B) y QA (C).<\/p><\/div>\n En el presente estudio, demostramos que QS-21 y su aglicona QA de Q. saponaria ejercen un efecto citot\u00f3xico en funci\u00f3n de la dosis contra las l\u00edneas celulares SNU1 y KATO III mediante el ensayo MTS. Adem\u00e1s, QS-21 y QA tienen un mejor efecto sobre las c\u00e9lulas SNU1 que sobre las KATO III. Adem\u00e1s, estos compuestos tienen un efecto bajo sobre la permeabilidad de la membrana celular evaluada mediante el ensayo de liberaci\u00f3n de LDH. De hecho, los resultados de la LDH indican que la alteraci\u00f3n metab\u00f3lica se produjo sin causar p\u00e9rdida en la integridad de la membrana. Teniendo en cuenta lo anterior, confirmamos, mediante ensayos de TUNEL, Annexin V y caspasas, que QS-21 y QA desencadenan un proceso de apoptosis, en el que QS-21 fue m\u00e1s eficaz para inducir la apoptosis en SNU1 que en KATO III.<\/p>\n Seg\u00fan el \u00edndice de hidrofobicidad calculado, QA (valor LogP de 1,85) podr\u00eda atravesar f\u00e1cilmente la membrana celular, mientras que QS-21 es el menos probable debido a su menor \u00edndice de hidrofobicidad (valor LogP de – 6,92). Por lo tanto, estos resultados (viabilidad y liberaci\u00f3n de LDH) estar\u00edan explicando por qu\u00e9 estos compuestos tienen una respuesta diferente en las c\u00e9lulas SNU1 y KATO III. De hecho, los estudios han demostrado que las saponinas triterpenoides y sus agliconas son capaces de inhibir la proliferaci\u00f3n y de inducir la muerte por apoptosis en varias l\u00edneas celulares cancerosas mediante un efecto l\u00edtico por permeabilizaci\u00f3n de las membranas o por una interacci\u00f3n con la membrana plasm\u00e1tica12,13. Las pruebas indican que la reorganizaci\u00f3n de las balsas lip\u00eddicas con Avicin D, otra saponina triterpenoide vegetal, estar\u00eda implicada en la supervivencia o muerte celular13,14,15,16. Por lo tanto, la QS-21 tambi\u00e9n podr\u00eda desencadenar la apoptosis celular mediante la reordenaci\u00f3n de las balsas lip\u00eddicas de la membrana celular o induciendo la trimerizaci\u00f3n de DR4 o FAS16,17. Los resultados del acoplamiento mostraron que el QS-21 se une m\u00e1s fuertemente al receptor DR4 que al receptor FAS, como se muestra en la Tabla 2. Adem\u00e1s, nuestros resultados de acoplamiento tambi\u00e9n mostraron que QS-21 y QA tienen mayor afinidad de uni\u00f3n a la prote\u00edna proapopt\u00f3tica BID, por lo que estos compuestos podr\u00edan estar implicados en la inducci\u00f3n de la apoptosis a trav\u00e9s de la prote\u00edna proapopt\u00f3tica, adem\u00e1s de la activaci\u00f3n de caspasas como la saikosaponina D en los hepatocitos17. Curiosamente, nuestros estudios de acoplamiento muestran que la QS-21 interact\u00faa con el dominio BH3 de la prote\u00edna proapopt\u00f3tica BID, al igual que los agentes anticancer\u00edgenos est\u00e1ndar como el venetoclax, el obatoclax, el navitoclax y la prodigiosina18,19,20. El dominio BH3 es una regi\u00f3n conservada en los miembros de la familia Bcl-2 y cr\u00edtica para iniciar la apoptosis21,22. Aunque QA y QS-21 comparten el mismo bolsillo de uni\u00f3n en la prote\u00edna BID, difieren tanto en orientaci\u00f3n como en conformaci\u00f3n al interactuar selectivamente con residuos espec\u00edficos del sitio de uni\u00f3n, incluidos los amino\u00e1cidos responsables del enlace de hidr\u00f3geno (ver Fig. 8), porque ambos compuestos tienen tama\u00f1os moleculares diferentes debido a los az\u00facares presentes en la estructura de QS-21.<\/p>\n Nuestro estudio ha demostrado que la QS-21 tiene efecto citot\u00f3xico sobre las c\u00e9lulas de c\u00e1ncer g\u00e1strico humano, mostrando valores de IC50 en torno a 7,4 \u00b5M para SNU1 y KATO III, casi 3 veces mejor que los estudios anteriores con saponina triterpenoide extra\u00edda de las ra\u00edces de Adenophora triphylla var. japonica23,24. Este hallazgo sugiere que la presencia del grupo acilo en la posici\u00f3n C28 podr\u00eda proporcionar una mayor citotoxicidad a la QS-21. Mientras que QA mostr\u00f3 valores de IC50 para SNU1 y KATO III en un rango similar (5-100 \u00b5M) al descrito con agliconas triterpenoides en diferentes l\u00edneas de c\u00e9lulas tumorales7,24,25,26. Adem\u00e1s, ambos compuestos fueron selectivos contra las c\u00e9lulas tumorales g\u00e1stricas sin afectar a la proliferaci\u00f3n de las c\u00e9lulas GES-1, como se muestra en la Fig. 2 y la Tabla 1.<\/p>\n En conclusi\u00f3n, nuestros hallazgos sugieren que el QS-21 y su aglicona QA tienen una importante actividad selectiva antitumoral in vitro contra las c\u00e9lulas de c\u00e1ncer g\u00e1strico humano, SNU1 y KATO III, induciendo la muerte celular mediante un mecanismo apopt\u00f3tico que implica la actividad de las caspasas y la fragmentaci\u00f3n del ADN. Sin embargo, en t\u00e9rminos de los perfiles IC50 obtenidos con ambos compuestos, QS-21 demostr\u00f3 ser un agente antitumoral m\u00e1s potente que QA. Es importante se\u00f1alar que para confirmar estos estudios in vitro y nuestros estudios de acoplamiento, ser\u00eda necesario evaluar en un futuro el mecanismo implicado en la generaci\u00f3n de la muerte celular, es decir, si QS-21 induce la muerte celular a trav\u00e9s de la v\u00eda extr\u00ednseca o intr\u00ednseca y evaluar si QA tienen capacidad para atravesar la membrana celular, desencadenando la muerte celular. Adem\u00e1s, ser\u00eda muy interesante evaluar la actividad antiproliferativa de la QS-21 y la QA en otras l\u00edneas celulares cancerosas.<\/p>\n L\u00edneas celulares<\/strong> Ensayos celulares<\/strong> Compuestos triterp\u00e9nicos<\/strong> Prueba de la actividad citot\u00f3xica mediante la prueba MTS<\/strong> Evaluaci\u00f3n de la actividad citot\u00f3xica mediante la liberaci\u00f3n de la enzima lactato deshidrogenasa (ensayo LDH) Ensayo de tinci\u00f3n TUNEL<\/strong> Ensayo de anexina V<\/strong> Ensayo de la actividad de las caspasas<\/strong> Predicci\u00f3n in silico de par\u00e1metros fisicoqu\u00edmicos y acoplamiento molecular<\/strong> Recurrimos al cribado virtual utilizando Autodock Vina, un m\u00e9todo de puntuaci\u00f3n de dianas espec\u00edficas \u00fatil para el cribado virtual30. QS-21 y QA se acoplaron a un conjunto de bolsillos de prote\u00ednas para identificar la prote\u00edna diana que podr\u00eda ser inhibida potencialmente por estos compuestos. Aqu\u00ed realizamos un acoplamiento r\u00edgido tomando todo el receptor para identificar los posibles bolsillos de uni\u00f3n de las prote\u00ednas. La estructura cristalina de las prote\u00ednas, incluidas las enzimas, el factor de crecimiento, los receptores y la prote\u00edna proapopt\u00f3tica, se recuper\u00f3 del Banco de Datos de Prote\u00ednas (PDB)31,32 utilizando los ID PDB 5CIR, 3CQW, 1F16, 2BID, 1E0O, 3EZQ y 3PZE (ver m\u00e1s informaci\u00f3n en la Tabla 2). Tanto los ligandos como las prote\u00ednas se prepararon utilizando AutoDock Tools versi\u00f3n 1.5.6 (ADT), como se ha descrito previamente32. Por \u00faltimo, el an\u00e1lisis gr\u00e1fico de los estudios de acoplamiento molecular se realiz\u00f3 con VMD33.<\/p>\n Procesamiento de datos y an\u00e1lisis estad\u00edstico<\/strong> <\/p>\n 1. <\/span>Luo, G. et al.<\/i> Patrones y tendencias mundiales en la incidencia del c\u00e1ncer de est\u00f3mago: An\u00e1lisis por edad, periodo y cohorte de nacimiento. Int. J. Cancer Glob. <\/i>141<\/b>, 1333-1344 (2017).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 2. <\/span>Housman, G. et al.<\/i> Resistencia a los f\u00e1rmacos en el c\u00e1ncer: Una visi\u00f3n general. C\u00e1nceres (Basilea).<\/i> 6<\/b>, 1769-1792 (2014).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 3. <\/span>Czajkowska, A. et al.<\/i> Efecto anticancer\u00edgeno de un nuevo derivado y su acci\u00f3n sin\u00e9rgica con Nigella sativa<\/i> en c\u00e9lulas humanas de c\u00e1ncer g\u00e1strico. Biomed. Res. Int. <\/i> 2017<\/b>, 1-13 (2017).<\/p>\n Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 4. <\/span>Moses, T. & Papadopoulou, K. K. Diversidad metab\u00f3lica y funcional de las saponinas, intermediarios biosint\u00e9ticos y derivados semisint\u00e9ticos. Crit. Rev. Biochem. Mol. 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Bull. <\/i> 34<\/b>, 831-838 (2011).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 8. <\/span>Kaufmann, T., Strasser, A. & Jost, P. J. Se\u00f1alizaci\u00f3n del receptor de muerte Fas: Roles de Bid y XIAP. Muerte Celular Difer.<\/i> 19<\/b>, 42-50 (2012).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 9. <\/span>Guicciardi, M. E. & Gores, G. J. Vida y muerte por receptores de muerte. FASEB J.<\/i> 23<\/b>, 1625-1637 (2009).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 10. <\/span>Kunii, K. et al.<\/i> Las l\u00edneas celulares de c\u00e1ncer g\u00e1strico amplificadas por FGFR2 requieren la se\u00f1alizaci\u00f3n de FGFR2 y Erbb3 para su crecimiento y supervivencia. Cancer Res.<\/i> 68<\/b>, 2340-2348 (2008).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 11. <\/span>Gavrieli, Y., Sherman, Y. & Ben-Sasson, S. A. Caracterizaci\u00f3n de la reducci\u00f3n celular del bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT): Localizaci\u00f3n subcelular, dependencia del sustrato e implicaci\u00f3n del transporte mitocondrial de electrones en la reducci\u00f3n del MTT. Arch. Biochem. Biophys. <\/i> 303<\/b>, 474-482 (1992).<\/p>\n Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 12. <\/span>Podolak, I., Galanty, A. & Sobolewska, D. Las saponinas como agentes citot\u00f3xicos: Una revisi\u00f3n. Fitoqu\u00edmica. Rev. <\/i> 9<\/b>, 425-474 (2010).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 13. <\/span>George, K. S. & Wu, S. Balsa de l\u00edpidos: Una isla flotante de muerte o supervivencia. Toxicol. Farmac. Aplic. <\/i> 259<\/b>, 311-319 (2012).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 14. <\/span>Tsai, C. et al.<\/i> Efecto de la saponina de soja en el crecimiento de c\u00e9lulas de c\u00e1ncer de colon humano. World J. Gastroenterol.<\/i> 16<\/b>, 3371-3376 (2010).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 15. <\/span>Li, J. et al.<\/i> La saponina 1 induce la apoptosis y suprime la se\u00f1alizaci\u00f3n de supervivencia mediada por NF-\u03baB en el glioblastoma multiforme (GBM). PLoS ONE<\/i> 8<\/b>, e81258 (2013).<\/p>\n ADS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 16. <\/span>Xu, Z. X., Ding, T., Haridas, V., Connolly, F. & Gutterman, J. U. La avicina D, un triterpenoide vegetal, induce la apoptosis celular mediante el reclutamiento de Fas y mol\u00e9culas de se\u00f1alizaci\u00f3n descendentes en balsas lip\u00eddicas. PLoS ONE<\/i> 4<\/b>, e8532 (2009).<\/p>\n ADS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 17. <\/span>Zhang, F. et al.<\/i> La activaci\u00f3n de la v\u00eda del receptor de muerte Fas y Bid en los hepatocitos est\u00e1 implicada en la inducci\u00f3n de hepatotoxicidad por saikosaponina D. Toxicol. Toxicol. Pharmacol. <\/i> 41<\/b>, 8-13 (2016).<\/p>\n Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 18. <\/span>Interacciones moleculares de las prodigininas con el dominio BH3 de los miembros antiapopt\u00f3ticos de la familia Bcl-2 .<\/i> PLoS ONE<\/i> 8<\/b>, 1-8 (2013).<\/p>\n Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 19. <\/span>Chen, G. et al.<\/i> A natural chalcone induces apoptosis in lung cancer cells: 3D-QSAR, docking and an in vivo\/vitro assay. Rep. Sci. Rep. <\/i> 7<\/b>, 1-10 (2017).<\/p>\n Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 20. <\/span>Ramos, J., Muthukumaran, J., Freire, F., Paquete-ferreira, J. & Santos-silva, T. Shedding light on the interaction of human anti-apoptotic Bcl-2 protein with ligands through biophysical and in silico studies. Int. J. Mol. Sci. Artic. <\/i> 20<\/b>, 860-872 (2019).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 21. <\/span>Chittenden, T. Dominios BH3: Ligandos de muerte intracelulares cr\u00edticos para iniciar la apoptosis. Cell Press.<\/i> 2<\/b>, 165-166 (2002).<\/p>\n CAS<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 22. <\/span>Huang, Z. La biolog\u00eda qu\u00edmica de la apoptosis: Revisi\u00f3n que explora las interacciones prote\u00edna-prote\u00edna y la vida y muerte de las c\u00e9lulas con peque\u00f1as mol\u00e9culas. Qu\u00edm. Biol. <\/i> 9<\/b>, 1059-1072 (2002).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 23. <\/span>Chun, J., Kang, M. & Kim, Y. S. Una saponina triterpenoide de la Adenophora triphylla var. japonica <\/i> suprime el crecimiento de las c\u00e9lulas de c\u00e1ncer g\u00e1strico humano mediante la regulaci\u00f3n de la apoptosis y la autofagia. Tumor Biol.<\/i> 35<\/b>, 12021-12030 (2014).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 24. <\/span>Lu, Y., Van, D., Deibert, L., Bishop, G. & Balsevich, J. Fitoqu\u00edmica antiproliferativa del \u00e1cido quill\u00e1ico y las saponinas gipsogeninas de las ra\u00edces de Saponaria officinalis<\/i> L. Fitoqu\u00edmica<\/i> 113<\/b>, 108-120 (2015).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 25. <\/span>Kikuchi, T. et al.<\/i> El \u00e1cido 3-O-(E)-p-cumaroyl tormentic de las hojas de Eriobotrya japonica<\/i> induce la muerte celular apopt\u00f3tica dependiente de caspasas en la l\u00ednea celular de la leucemia humana. Qu\u00edm. Pharm. Bull. <\/i> 59<\/b>, 378-381 (2011).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 26. <\/span>Panucci, R. K. I., Oliveira, C. R., de Mello Marin, W. & Bincoletto, C. Estudio in vitro del potencial antileuc\u00e9mico del \u00e1cido urs\u00f3lico en la l\u00ednea celular Jurkat. J. Clin. Exp. Oncol. <\/i> 5<\/b>, 3 (2016).<\/p>\n Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 27. <\/span>Rodr\u00edguez-d\u00edaz, M., Delporte, C., Cartagena, C. & Wessjohann, L. A. Actividad antiinflamatoria t\u00f3pica del \u00e1cido quil\u00e1ico de Quillaja saponaria<\/i> Mol. y algunos derivados. Farmac. Pharmacol. <\/i> 3<\/b>, 718-724 (2011).<\/p>\n Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 28. <\/span>Pregi, N., Vittori, D., P\u00e9rez, G., Leir\u00f3s, C. P. & Nesse, A. Efecto de la eritropoyetina sobre la apoptosis inducida por estaurosporina y la diferenciaci\u00f3n de las c\u00e9lulas de neuroblastoma SH-SY5Y. Biochim. Biophys. Acta <\/i> 1763<\/b>, 238-246 (2006).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 29. <\/span>Antonsson, A. & Persson, J. L. La inducci\u00f3n de la apoptosis por la estaurosporina implica la inhibici\u00f3n de la expresi\u00f3n de las principales prote\u00ednas del ciclo celular en el punto de control G2\/M, acompa\u00f1ada de alteraciones en las actividades de las cinasas Erk y Akt. Anticancer Res.<\/i> 29<\/b>, 2893-2898 (2009).<\/p>\n CAS<\/a> PubMed<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 30. <\/span>Trott, O. & Olson, A. J. AutoDock Vina: Mejora de la velocidad y precisi\u00f3n del docking con una nueva funci\u00f3n de puntuaci\u00f3n, optimizaci\u00f3n eficiente y multihilo. J. Comput. Chem. <\/i> 31<\/b>, 455-461 (2009).<\/p>\n Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 31. <\/span>Berman, H. M. et al.<\/i> El banco de datos de prote\u00ednas. Nucleic Acids Res.<\/i> 28<\/b>, 235-242 (2000).<\/p>\n ADS<\/a> CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 32. <\/span>Molinari, A. et al.<\/i> Benzoindazolequinonas antiproliferativas como inhibidores potenciales de la ciclooxigenasa-2. Molecules<\/i> 24<\/b>, 1-17 (2019).<\/p>\n Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n 33. <\/span>Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. V. M. D. Din\u00e1mica molecular visual. J. Mol. Graf. <\/i> 14<\/b>, 33-38 (1996).<\/p>\n CAS<\/a> Art\u00edculo<\/a> Google Acad\u00e9mico<\/a><\/p>\n Agradecimientos<\/strong> Afiliaciones<\/strong> Natural Response S.A, Av. Industrial 1970, Quilpu\u00e9, Regi\u00f3n de Valpara\u00edso, Chile Laboratorio de Biolog\u00eda Molecular y Celular del C\u00e1ncer, Departamento de Ciencias Biom\u00e9dicas, Facultad de Medicina, Universidad Cat\u00f3lica del Norte, Coquimbo, Chile<\/strong> Laboratorio de Qu\u00edmica Org\u00e1nica, Instituto de Qu\u00edmica, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Cat\u00f3lica de Valpara\u00edso, Valpara\u00edso, Chile<\/strong> Laboratorio de Oncolog\u00eda, Departamento Hematolog\u00eda y Oncolog\u00eda, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Cat\u00f3lica de Chile, Santiago, Chile<\/strong> Centro Avanzado de Enfermedades Cr\u00f3nicas, Santiago, Chile<\/strong> Contribuciones<\/strong> Resumen Se estudi\u00f3 el mecanismo citot\u00f3xico de la saponina QS-21 y su aglicona \u00e1cido quil\u00e1ico (QA) en c\u00e9lulas de c\u00e1ncer g\u00e1strico humano (SNU1 y KATO III). Ambos compuestos mostraron actividad citot\u00f3xica in vitro con valores de IC50 7,1 \u03bcM (QS-21) y 13,6 \u03bcM (QA) en c\u00e9lulas SNU1; 7,4 \u03bcM (QS-21) y 67 \u03bcM (QA) en […]<\/p>\n","protected":false},"author":7,"featured_media":2754,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"rs_blank_template":"","rs_page_bg_color":"","slide_template_v7":"","footnotes":""},"categories":[],"tags":[],"class_list":["post-3131","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/3131","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/users\/7"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=3131"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/3131\/revisions"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/media\/2754"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=3131"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=3131"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/desertking.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=3131"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}Resultados<\/h3>\n
\nPara determinar el potencial terap\u00e9utico de QS-21 y QA en el tratamiento del c\u00e1ncer g\u00e1strico, comprobamos primero su impacto en la viabilidad de las l\u00edneas celulares in vitro KATO III, SNU1 y GES-1, mediante el ensayo MTS11.<\/p>\n![\"\"](\"https:\/\/desertking.com\/wp-content\/uploads\/2020\/07\/41598_2020_67442_fig2_html.png\")
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\nCuando se incubaron c\u00e9lulas SNU1 con 10 \u00b5M de QS-21 durante 24 h, se produjo un 82% (P<0,0001) de c\u00e9lulas TUNEL positivas en comparaci\u00f3n con las c\u00e9lulas no tratadas, como se muestra en la Fig. 5A, C, mientras que la incubaci\u00f3n con 100 \u00b5M de QA alcanz\u00f3 un 36% (P <0,005) de c\u00e9lulas TUNEL positivas (Fig. 5C, D). El efecto de QA a 100 \u00b5M sobre las c\u00e9lulas KATO III dio lugar a porcentajes bajos de da\u00f1o del ADN que alcanzaron el 15% (P<0,005), como se muestra en la Fig. 5D. El tratamiento de las c\u00e9lulas KATO III con QS-21 (10 \u03bcM) mostr\u00f3 un efecto destacado en la inducci\u00f3n de la apoptosis celular, generando un 50% (P<0,0001) de c\u00e9lulas TUNEL positivas (Fig. 5B, D). Curiosamente, observamos que QS-21 es m\u00e1s eficaz que QA y STS para desencadenar la fragmentaci\u00f3n del ADN en SNU1 y KATO III. Para confirmar este resultado obtenido mediante el ensayo TUNEL, empleamos la citometr\u00eda de flujo utilizando Annexin V y 7-aminoactinomicina D. Los resultados de la apoptosis se muestran en la Fig. 6, donde el porcentaje de c\u00e9lulas SNU1 sometidas a muerte celular apopt\u00f3tica aument\u00f3 hasta el 42% y el 72% para QA y QS-21, respectivamente, en comparaci\u00f3n con las c\u00e9lulas no tratadas. En el caso de KATO III, tras la exposici\u00f3n a 100 \u03bcM de QA o 10 \u03bcM de QS-21 alcanz\u00f3 el 73% y el 49%, respectivamente (Fig. 6). Por \u00faltimo, comprobamos la inducci\u00f3n de las caspasas 3\/7 en ambas l\u00edneas celulares tumorales con 10 \u00b5M de QS-21 y 100 \u00b5M de QA durante 24 h, lo que produjo una inducci\u00f3n significativa de la actividad de las caspasas 3\/7 en comparaci\u00f3n con el control negativo (P<0,0001), como se observa en la Fig. 7.<\/p>\n![\"\"](\"https:\/\/desertking.com\/wp-content\/uploads\/2020\/07\/41598_2020_67442_fig5_html.png\")
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\nLa Tabla 2 muestra las energ\u00edas de uni\u00f3n predichas (\u0394Gbinding) para los compuestos en complejo con un conjunto de prote\u00ednas relacionadas con el c\u00e1ncer con estructura 3D conocida sobreexpresadas en varias l\u00edneas celulares de c\u00e1ncer, las l\u00edneas celulares SNU1 y KATO III. Entre las prote\u00ednas mencionadas, tanto el QS-21 como el QA se unen m\u00e1s fuertemente a la prote\u00edna proapopt\u00f3tica BID (entrada PDB: 2BID) que a otras prote\u00ednas, con valores de \u0394Gbinding – 8,2 y – 9,9 kcal\/mol, respectivamente.<\/p>\n![\"\"](\"https:\/\/desertking.com\/wp-content\/uploads\/2020\/07\/captura-de-pantalla-2020-07-02-a-las-23.35.11.png\")
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Debate<\/h3>\n
Materiales y m\u00e9todos<\/h3>\n
\nLas l\u00edneas celulares humanas de GC (SNU1 y KATO III) se obtuvieron de la American Type Culture Collection ATCC (Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvieron en RPMI 1.640 suplementado con un 10% de FBS, penicilina 100 U\/mL y estreptomicina 100 \u03bcg\/mL. Como control sano se utiliz\u00f3 la l\u00ednea celular epitelial g\u00e1strica humana (GES-1), mantenida en medio DMEM (amablemente donado por el Dr. Dawit Kidane-Mulat de la Universidad de Texas-Austin).<\/p>\n
\nEnsayo MTS Ensayo de proliferaci\u00f3n CellTiter 96 AQueous One Solution, sistema TUNEL fluorom\u00e9trico Dead End y ensayo Caspase-Glo 3\/7 adquiridos a Promega, (Madison, WI, EE.UU.). Click-it TUNEL Alexa Fluor 594 de Life Technologies. Ensayo de c\u00e9lulas muertas y anexina V de Muse (Merck, Millipore, EE.UU.). LDH-Cytotoxicity Assay se adquiri\u00f3 a Thermo Scientific (Thermo, Waltham, MA, EE.UU.). La estaurosporina (STS), el yoduro de propidio (PI) y el cisplatino se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Los medios de cultivo celular (RPMI1640, DIMEN) y el suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), as\u00ed como los antibi\u00f3ticos (penicilina y estreptomicina) se adquirieron a Corning CellGro (Nueva York, NY, EE.UU.).<\/p>\n
\nLas muestras de QS-21 y QA fueron suministradas por Desert King International (CA, EE.UU.). El QS-21 se purific\u00f3 a partir de un extracto altamente purificado de la corteza de Q. saponaria (SuperSap, Desert King International). El extracto se fraccion\u00f3 mediante HPLC preparativa de fase inversa en una columna de octadecilsilano eluida con un gradiente de agua acidificada y acetonitrilo siguiendo un enfoque general descrito en otro lugar 6. Las fracciones que conten\u00edan QS-21 se agruparon y liofilizaron, obteni\u00e9ndose la fracci\u00f3n QS-21 empleada en este estudio. La QA se prepar\u00f3 mediante hidr\u00f3lisis \u00e1cida del extracto altamente purificado de Q. saponaria (VaxSap, Desert King International, CA, EE.UU.), siguiendo un procedimiento general descrito en otro lugar por Rodr\u00edguez-D\u00edaz et al.27. Para las pruebas biol\u00f3gicas de QS21 y QA, se prepar\u00f3 una soluci\u00f3n madre de cada compuesto en dimetilsulf\u00f3xido (DMSO) (2,5 mM y 0,1 mM, respectivamente).<\/p>\n
\nSe sembraron SNU1, KATO III y GES-1 (5 \u00d7 105 c\u00e9lulas\/pocillo) en una placa de 96 pocillos en el medio respectivo y se incubaron durante 24 h a 37 \u00b0C en una atm\u00f3sfera humidificada con un 5% de CO2 para recuperar las c\u00e9lulas. Se probaron ambos compuestos durante 24 h; QS-21 (0-50) \u00b5M en c\u00e9lulas SNU1, KATO III y GES-1, respectivamente; QA (0-250) \u00b5M en c\u00e9lulas SNU1, KATO III y GES-1, respectivamente. El STS, un inhibidor de la prote\u00edna cinasa, se utiliz\u00f3 como control positivo de la muerte en las l\u00edneas celulares SNU1 y KATO III determinada mediante el ensayo MTS, utilizando las concentraciones descritas en la bibliograf\u00eda28,29 (Material suplementario S1). El ensayo MTS se realiz\u00f3 seg\u00fan las instrucciones del fabricante. A continuaci\u00f3n, se registr\u00f3 la absorbancia a 490 nm utilizando un lector ELISA Epoch (ELx800, BioTek, VT, EE.UU.). Las c\u00e9lulas tratadas con DMSO 0,2% o PBS se incluyeron como control del veh\u00edculo. La viabilidad celular (expresada como porcentaje de la viabilidad de las c\u00e9lulas no expuestas a QS-21o QA). El experimento se realiz\u00f3 por triplicado. Se determinaron los valores IC50 para QS-21 y QA.<\/p>\n
\nEl efecto citot\u00f3xico de ambos compuestos triterp\u00e9nicos sobre la integridad de la membrana celular se determin\u00f3 detectando la liberaci\u00f3n de LDH al medio extracelular. Se sembraron 3 \u00d7 105 c\u00e9lulas\/pocillo (SNU1 y KATO III) en una placa negra de 96 pocillos con RPMI 1.640 como se ha descrito anteriormente. Cada compuesto triterp\u00e9nico se a\u00f1adi\u00f3 a las suspensiones celulares a las siguientes concentraciones: (1) QS-21, 0-12 \u00b5M; (2) QA, 0-125 \u00b5M. El ensayo de citotoxicidad de la LDH se realiz\u00f3 seg\u00fan las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midi\u00f3 a 490 nm y 680 nm utilizando un lector ELISA Epoch (ELx800, BioTek, VT, EE.UU. un espectrofot\u00f3metro de lectura en placa para determinar la actividad de la LDH. La citotoxicidad se expres\u00f3 en porcentaje. El experimento se realiz\u00f3 por triplicado.<\/p>\n
\nSe sembraron 1 \u00d7 105 c\u00e9lulas de SNU1 y KATO III en una placa de 35 mm como se ha descrito anteriormente. A continuaci\u00f3n, se a\u00f1adieron a las c\u00e9lulas QS-21 (10 \u00b5M), QA (100 \u00b5M) o STS (control positivo de la apoptosis celular); la concentraci\u00f3n de STS en cada ensayo fue de 0,3 \u00b5M (SNU1) y 3,0 \u00b5M (KATO III), y se incubaron durante 24 h en las condiciones anteriores (figura suplementaria S1). Las c\u00e9lulas SNU1 se analizaron utilizando el kit del sistema TUNEL fluorom\u00e9trico Dead End seg\u00fan las instrucciones del fabricante. Las c\u00e9lulas KATO III se analizaron utilizando el kit Click-it TUNEL Alexa Fluor 594. El motivo de utilizar un kit diferente fue la elevada fluorescencia de fondo inespec\u00edfica con el primer kit. Brevemente, las c\u00e9lulas SNU1 y KATO III incubadas se fijaron, permeabilizaron y marcaron con fluoresce\u00edna 12-dUTP y Alexa Fluor 594, respectivamente. Este paso se realiz\u00f3 en un microscopio de fluorescencia Nikon H550L equipado con filtros de fluorescencia est\u00e1ndar ajustados a: (1) 520 nm para visualizar las c\u00e9lulas SNU1 apopt\u00f3ticas marcadas con Fluoresce\u00edna-12-dUTP (fluorescencia verde); (2) 460 nm para visualizar todas las c\u00e9lulas SNU1 te\u00f1idas con Yoduro de propidio (PI: fluorescencia roja); (3) 590 nm para visualizar las c\u00e9lulas apopt\u00f3ticas KATO III te\u00f1idas con Alexa Fluor 594 (fluorescencia roja), y (4) 490 nm para visualizar la fluorescencia azul de todas las c\u00e9lulas KATO III te\u00f1idas con Hoechst 33342. Las c\u00e9lulas se fotografiaron en 8 campos diferentes con un aumento de 400X.<\/p>\n
\nSe sembraron 2 \u00d7 105 c\u00e9lulas de SNU1 y KATO III en placas de 6 pocillos como se ha descrito anteriormente. A continuaci\u00f3n, las c\u00e9lulas SNU1 y KATO III se suplementaron con QS-21 (5 \u00b5M) o QA (100 \u00b5M). Se utiliz\u00f3 cisplatino (55 \u00b5M) como control positivo y c\u00e9lulas no tratadas como control negativo. Todos los ensayos se incubaron durante 24 h. Tras la incubaci\u00f3n, las c\u00e9lulas se lavaron con 1 mL de PBS y se a\u00f1adieron 100 \u00b5L del reactivo Muse Annexin V& Dead Cell. La apoptosis se midi\u00f3 con el analizador celular Muse y el software de an\u00e1lisis Muse (Merck-Merck Millipore) y las c\u00e9lulas se clasificaron en cuatro grupos: vivas, apopt\u00f3ticas tempranas, apopt\u00f3ticas tard\u00edas y muertas o necr\u00f3ticas.<\/p>\n
\nSe sembraron 2 \u00d7 104 c\u00e9lulas (SNU1 y KATO III) en placas de 96 pocillos como se ha descrito anteriormente. A continuaci\u00f3n, las c\u00e9lulas se suplementaron con QS-21 (5 \u00b5M) o QA (100 \u00b5M), y se incubaron durante 24 h. Las actividades de las caspasas 3 y 7 tras la incubaci\u00f3n de las c\u00e9lulas se detectaron mediante el ensayo Caspase-Glo 3\/7 siguiendo las instrucciones del fabricante. La fluorescencia de los lisados (proporcional a la cantidad de actividad de las caspasas presente) se midi\u00f3 a 510 nm en un lector de placas de fluorescencia multipocillo Appliskan (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE.UU.).<\/p>\n
\nLa estructura 2D de QA (CID: 101.810) y QS-21 (CID: 73.652.135) se recuper\u00f3 en formato de archivo SDF de la base de datos PubChem del NCBI (https:\/\/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Estas mol\u00e9culas se visualizaron y sus valores de pKa y LogD se calcularon con el software Marvin Sketch (versi\u00f3n 18.24.0, ChemAxon Ltd.). Las concentraciones de Cl- y Na+ K+ se fijaron en 0,108 mol\/L y 0,133 mol\/L, respectivamente, para el c\u00e1lculo del logD. Para el c\u00e1lculo de pKa y LogD se tuvo en cuenta la tautomerizaci\u00f3n para QA y QS-21.<\/p>\n
\nLos resultados se expresaron como media \u00b1 desviaci\u00f3n est\u00e1ndar (DE). Los datos se analizaron mediante an\u00e1lisis de dos v\u00edas y de una v\u00eda (ANOVA) con la prueba de comparaciones m\u00faltiples de Tukey (P<0,005) utilizando GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.).<\/p>\nReferencias<\/h3>\n
\nAgradecemos especialmente al Dr. Dawit Kidane-Mulat (Universidad de Texas -Austin) que don\u00f3 las c\u00e9lulas GES-1 (l\u00ednea celular de epitelio g\u00e1strico normal). Damos las gracias a Hugo Verli y Conrado Pedebos (Biotecnolog\u00eda de la Universidad de Federal do Rio Grande do Sul), por facilitarnos la estructura tridimensional de QS-21. Con el apoyo de la Direcci\u00f3n de Investigaci\u00f3n de la Vicerrector\u00eda de Investigaci\u00f3n y Estudios Avanzados. Pontificia Universidad Cat\u00f3lica de Valpara\u00edso, Chile [DI0 .37-274\/DI037.227], DESERT KING Chile, CONICYT-FONDAP 15130011, CONICY-Becas N\u00b021141206\/N\u00ba 21151252.<\/p>\nInformaci\u00f3n del autor<\/h3>\n
\nLaboratorio de Qu\u00edmica Biol\u00f3gica, Instituto de Qu\u00edmica, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Cat\u00f3lica de Valpara\u00edso, Valpara\u00edso, Chile<\/strong>
\nLeda Guzm\u00e1n, Katherine Villal\u00f3n, Mar\u00eda Jos\u00e9 Marchant, Mar\u00eda Elena Tarnok, Pilar C\u00e1rdenas, Gisela Aquea & Waldo Acevedo<\/p>\n
\nLeandro Padilla<\/p>\n
\nGiuliano Bernal<\/p>\n
\nAurora Molinari<\/p>\n
\nAlejandro Corval\u00e1n<\/p>\n
\nAlejandro Corval\u00e1n<\/p>\n
\nL.G., A.M., W.A., A.C. y L.P. redactaron el manuscrito principal; M.J.M., P.C. y M.E.T. realizaron la MTS. y LDH. ensayo: K.V. y G.A. realizaron el ensayo TUNEL, de caspasas y de muerte. L.P. prepar\u00f3 la Fig. 1; L.G., K.V. y G.A. prepararon las Figs. 2, 3, 4, 5, 6 y 7; W.A. realiz\u00f3 el an\u00e1lisis de acoplamiento, Fig. 8 y Tabla 2. G.B. y A.C. contribuyeron a la revisi\u00f3n del manuscrito. Todos los autores revisaron la versi\u00f3n final del manuscrito.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"